Главная

• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Получение антигенных субстратов

В качестве антигенных субстратов, как правило, используют срезы ткани, клетки, клеточные органеллы. Во время подготовки объекта следует обращать внимание как на морфологическую сохранность объекта, так и на сохранность антигенного состава. В большинстве случаев приходится отказываться от фиксации тканей и срезов. Если все же фиксация необходима в силу отсутствия криотома, растворимости антигенов или невозможности удержать объект на предметном стекле, то необходимо заранее определить, какое воздействие оказывает фиксатор на антигенность. При плохом прилипании объекта к стеклу можно попытаться очистить его нитросерной кислотой, обработать смесью хромовых квасцов с желатином, формваром (Serva) или метасиликатом. Перед работой анализируемые препараты подсушивают на воздухе в течение 10—20 минут. Препараты можно сохранять в отсутствие доступа воздуха при —20 °С, если предварительно дать им подсохнуть при 40—50 °С в течение 30 минут. Известны способы консервации антигенов на срок более года. После осторожного подсушивания препарат нагревают в течение 10 минут при 100 °С и осторожно завертывают в алюминиевую фольгу. Препараты сохраняют при —20 °С, перед употреблением длительно акклиматизируют. Для быстрого анализа препарата рекомендуют окрашивание акридиновым оранжевым (100 мг/л, 10 с, отмывка водопроводной водой); рассматривают в тех же условиях, что и препараты, окрашенные ФИТЦ. В зависимости от величины препарата приходится просматривать различное число полей зрения. Маленькие объекты удобно рассматривать на специальных шаблонах.

Специальные приспособления для иммунофлюоресцентного анализа

а — устройство для шок-замораживания (медный цилиндр, погружаемый в сосуд Дьюара с жидким азотом);
б — инкубационная камера;
в — устройство для получения отпечатков ткани;
г — штамп для предметных стекол;
д—устройство для повторного отыскания микрообъектов.

Приготовление криосрезов

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: изопентан (Fluka), жидкий азот, ОСТ (Miles, США); предметные стекла нефлюоресцирующие, очищенные нитросерной кислотой (20 г нитрата калия в 1 л концентрированной серной кислоты); криотом.

Методика. Образцы только что полученной ткани (толщиной не более 5 мм) подвергают шок-замораживанию изопентаном, охлажденным жидким азотом. Для охлаждения можно также использовать смесь ацетона и сухого льда. Небольшие кусочки ткани (например, биопсийный материал) перед замораживанием заключают в ОСТ, 20% желатин или печень крысы. Высыхание замороженной ткани можно предотвратить, помещая образцы в небольшие пластиковые пакетики или сосуды. В случаях быстрого использования (до 8 нед) ткань можно хранить при —20 °С. Если возникает необходимость более длительного хранения, рекомендуется использовать жидкий азот. Криосрезы толщиной 4—6 мкм прикрепляют к предметному стеклу и обрабатывают, как описано выше.

Препараты культур клеток, мазки и отпечатки

Из суспензии культуры клеток (оптимальное число клеток в 10 мкл — 5-10⁴Х увеличение объектива) можно приготовлять мазки для иммунофлюоресцентного анализа. Для предотвращения смывания клеток при последующих процедурах необходимо проводить специальную обработку стекла (см. выше) или фиксировать препарат. Клеточная суспензия лучше распределяется по стеклу при добавлении сывороточного альбумина в количестве 5 г/л. После этого необходима фиксация препарата. Культуры клеток на покровных стеклах очень удобны для иммунофлюоресцентного анализа. Покровные стекла перед анализом укрепляют на предметных стеклах пиафлексом или энтелланом (см. ниже). Отпечатки особенно удобно использовать для изучения ядер. Поверхностью свежего среза несколько раз прикасаются к предметному стеклу. Перед каждым новым срезом кусочек ткани несколько выдвигают из держателя (см. рисунок выше, в).

Срезы парафинированных тканей

Если необходимо очень высокое качество гистологических препаратов или отсутствует криотом, то образцы тканей можно в добавление к фиксации спиртом или формалином заключать в парафин. Влияние этих манипуляций на иммунологические свойства антигенов выяснены еще недостаточно. Если в результате фиксации антигены маскируются, обработка ферментами может частично или полностью восстановить их доступность.