Главная

• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Реакция гемагглютинации. Методика

Материалы и оборудование. Для работы необходимы микротитратор Такачи (MIM, Венгрия), мешалка, водяная и ледяная бани; смесь ацетон + сухой лед, бензидин 0,2 М HCl, NaN0₂, йодкрахмальная бумага, глутаровый альдегид (Serva, ФРГ), мертиолят, 0,15 М NaCl, забуференный 0,15 М NaCl рН 7,2 (ФСБ) (23,9 мл 0,15 М КН₂Р0₄, 76 мл 0,15 М Na₂HP0₄, 100 мл 0,15 М NaCl), ФСБ рН 6,4 (67,7 мл 0,15 М КН₂Р0₄, 32,3 мл 0,15 М Na₂HP0₄, 100 мл 0,15 М NaCl), формалин (33% водный раствор редистиллированного формальдегида, смешанного с равным объемом ФСБ рН 7,2 двойной концентрации), таннин (Fluka, Швейцария) 1:20 000 в ФСБ рН 7,2 (исходный раствор 1:100 в дистиллированной воде сохраняют при 4°С), 0,15 М фосфатный буфер рН 7,4 [4,1 мл 0,5 М Na₂HP0₄ · 2H₂0 (22,25 г/250 мл), 0,9 мл 0,5 М NaH₂P0₄ · H₂0 (17,25 г/250 мл), 17,7 мл дистиллированной воды], эритроциты барана или человека (0, rh) в растворе Олсвера, ЧСА, среда для разведения (ФСБ рН 7,2+1% инактивированной адсорбированной эритроцитами лошадиной сыворотки).

Приготовление бис-диазобензидина

Бензидин в количестве 0,23 г (канцероген! работать в резиновых перчатках) растворяют в 45 мл 0,2 М НСl. Раствор охлаждают на ледяной бане. Растворяют 0,175 г NaN0₂ в 5 мл дистиллированной воды, раствор охлаждают и, постоянно помешивая, добавляют по каплям в течение 1 минуты к раствору бензидина. Реакцию диазолирования проводят на ледяной бане до тех пор, пока йодкрахмальная бумага не перестанет обнаруживать свободный нитрит (среднее время реакции 30 минут). Готовый светло-желтый БДБ-реактив на ледяной бане разливают в ампулы по 1 мл (при работе пипетку в рот не брать!!!), замораживают в смеси ацетон + сухой лед. При —70 °С материал можно сохранять в течение нескольких месяцев.

Фиксирование эритроцитов

Форм альдегидный метод: 5 объемов крови смешивают с 5 объемами ФСБ с рН 7,2 и быстро смешивают с 4 объемами формалина (16,5% раствор в ФСБ с рН 7,2). Инкубируют смесь 2 часа на водяной бане при 37 °С, помешивая каждые 15 мин. По окончании формалинизации эритроциты 6 раз отмывают ФСБ с рН 7,2 (низкоскоростное центрифугирование или свободная седиментация в течение 1 дня), готовят 10% суспензию. Консервируют 0,3% формальдегидом, эритроциты сохраняются в течение нескольких месяцев, при 4°С.

Глутаральдегидный метод: трижды отмытый физиологическим раствором осадок эритроцитов охлаждают до 0°С на водяной бане. 25% глутаровый альдегид разводят до 1% раствором следующего состава: 1 часть 0,15 М Na₂HP0₄ с рН 8,2 + 9 частей 0,15 М NaCl + 5 частей дистиллированной воды, охлаждают смесь на ледяной бане. Разводят осадок эритроцитов 1% глутаровым альдегидом до 1—2% суспензии, инкубируют 30 минут при 0°С при периодическом перемешивании (фиксация). Фиксированные эритроциты отмывают 5 раз 0,15 М NaCl и 5 раз дистиллированной водой (низкоскоростное центрифугирование). Сохраняют их в виде 30% суспензии а дистиллированной воде с добавлением 0,01% мертиолята в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Таннизирование и сенсибилизация эритроцитов

Отмытые фиксированные эритроциты (10% в ФСБ с рН 7,2) смешивают с равным объемом раствора таннина 1:20 000 в ФСБ с рН 7,2. Инкубируют 10 минут при комнатной температуре, трижды отмывают ФСБ с рН 7,2. Для сенсибилизации смешивают 4 мл ФСБ с рН 6,4, 1 мл оптимального разведения антигена в 0,15 М NaCl и 1 мл 5% суспензии эритроцитов или таннизированных эритроцитов. Инкубируют 20 минут при комнатной температуре, трижды отмывают ФСБ с рН 7,2 с 0,2% ЧСА. Готовят суспензии эритроцитов для титрования в растворе NaCl.

Конъюгирование глутаровым альдегидом

К 3,2 мл раствора белка (оптимальную концентрацию определяют индивидуально; для бычьего γ-глобулина — 2,5 мл/3,2 мл) в 0,15 М фосфатном буфере с рН 7,4 добавляют 0,1 мл отмытого осадка эритроцитов и при постоянном перемешивании добавляют 0,1 мл 0,25% водного раствора глутарового альдегида. Смесь инкубируют 1 час при комнатной температуре. После 3-кратной отмывки конъюгированные эритроциты можно немедленно использовать или хранить в течение нескольких недель в 0,15 М NaCl в холодильнике.

Постановка реакции

Реакция прямой гемагглютинации. Для инактивации комплемента с целью предотвращения иммунного гемолиза исследуемую сыворотку нагревают в течение 30 мин при 56°С. Затем готовят геометрический ряд разведений (1 + 1 или 1+2), смешивают полученные разведения с суспензией эритроцитов. При постановке реакции в пробирках антисыворотку разводят 0,5 мл среды (0,15 М NaCl или ФСБ с рН 7,2 с 1% инактивированной лошадиной сывороткой, адсорбированной тестерными эритроцитами) и добавляют к каждому разведению по 0,075 мл 2,5% суспензии эритроцитов. При постановке микротеста сыворотку разводят непосредственно в планшетах при помощи многоканальных пипеток, перенося по 25 .мкл содержимого из одной лунки в другую (в лунки предварительно внесено по 250 мкл среды). Затем добавляют по 25 мкл 0,4% суспензии эритроцитов. После перемешивания смесь оставляют на 2—3 часа при комнатной температуре, результат оценивают визуально (можно при помощи лупы). Реакция считается положительной (есть гемагглютинация), когда на дне сосуда образуется широкий, неправильной формы «коврик». В случае пробирочного варианта РГА качественную оценку проводят в баллах от + до + + + +. Если эритроциты седиментировали в виде плотной полугранулы, реакция считается отрицательной. Количественную оценку реакции выражают в титрах. Обратная величина разведения сыворотки, еще способного вызывать - агглютинацию, принимается за титр. На рисунке изображены результаты титрования в микропланшете.

Микро-гемагглютинация и -пассивная гемагглютинация по Takatsy

первый ряд: анти-А-сыворотка+эритроциты группы А;
второй ряд — аити-А-сыворотка + эритроциты В;
третий ряд: аити-В-сыворотка + эритроциты В;
четвертый ряд: антн-В-сыворотка + эритроциты А;
ряды 5—8-й: сыворотка, содержащая ревматоидный фактор и ЭБ, сенсибилизированные амбоцептором (тест Ваалера — Розе).

Реакция пассивной гемагглютинации. Титруемую антисыворотку инактивируют. Адсорбируют ее индикаторными эритроцитами (1 часть эритроцитов + 4 части сыворотки; 20 мин при 20 °С) для удаления присутствующих в большинстве сывороток гетерофильных антител, особенно антител к антигену Форссмана. Титрование смотри выше.