Главная

Метод мембранной иммунофлюоресценции. Необходимые условия

Приготовление и маркировка антител

Приготовление меченных флюорохромом антител уже было описано ранее. Из свойств конъюгатов особое значение имеет молярное соотношение белка и флюорохрома, поскольку оно используется для количественной оценки соотношения специфической флюоресценции и неспецифического окрашивания. Требования, предъявляемые к конъюгатам, используемым в мембранной иммунофлюоресценции, очень высоки.

Критерии оценки конъюгатов

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16


Специфичность сыворотки

Источник сыворотки (иид животного)

Серия и фирма-изготовитель

Общее количество белка

Количество белка антител

Количество и характер примеси других белков

Общее содержание флюорохрома

Содержание флюорохрома, связанного с белками

Содержание не связанного с белками флюорохрома

«Флюорохромный профиль»

Соотношение флюорохром/общий белок

Соотношение белок АТ/общий белок

Соотношение белок АТ/флюорохром

Вид и количество консервантов и других добавок

Данные о контроле специфичности иа модельной системе с указанием на неспецифические реакции

Оптимальное разведение в стандартной тест-системе
 

 

Требования к конъюгату для мембранной иммунофлюоресценции

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10
 Содержание антител (не меньше 1 г/л)

Молярное соотношение флюорохром : антитело должно составлять 1 : 2

Содержание общего белка (около 2 г/л)

Соотношение белок АТ/общий белок 0,5

Антитела должны представлять собой Fab- или Р(аb)2-фрагменты для предотвращения связывания комплемента

Антитело не должны давать перекрестных реакций

Должен отсутствовать «балластный белок» эозинофилов и базофилов

При низком общем содержании белка (ниже 2 г/л) для стабилизации добавляют альбумин (10—40 г/л)

Антитела должны обладать высокой авидностью

 Конъюгаты должны быть испытаны в модельной системе на специфичность
 

 

Оптимальные рабочие разведения AC, АТ (антитело) или конъюгатов подбираются индивидуально для каждой системы. В ходе титрования желательно работать в области плато и использовать разведение сыворотки на две ступени выше, чем то, которое соответствует концу плато. Поскольку при МИФ не всегда удается достигнуть плато, то для достоверности можно использовать неразведенные или слабо разведенные сыворотки, например 1:10. Вторые АТ (антитело) особенно часто используют без разведения в непрямом МИФ. Условия конъюгации описаны в соответствующей статье.

Микроскопическое оснащение

К микроскопам, используемым в МИФ, предъявляются следующие требования.

1. Возможность попеременно и одновременно проводить наблюдения в фазовом (или интерференционном) контрасте, проходящем и отраженном свете.

2. Сильный источник света (например, ртутная лампа высокого давления НВО 200), расположенный по возможности вблизи от препарата и снабженный охлаждающим устройством для предотвращения повреждений интерференционного фильтра.

3. Полный набор возбуждающих фильтров, ультрафиолетовых, узкополосных и селективных, для работы с ФИТЦ и ТРИТЦ, соответствующие интерференционные зеркала и запирающие фильтры.

4. Возможность работы с одной и с двумя флюорохромными метками.

5. Объективы самого высокого качества [большая апертура, система обычных и иммерсионных сред (масло, вода или глицерин)] для микроскопии и фотографии.

6. Окуляры с небольшим увеличением (не более х б,3).

7. Автоматическая камера для микрофотографирования.

Для решения специальных вопросов используют добавочные приспособления.

Микрофлюориметрия: в этом методе измеряют интенсивность флюоресценции отдельных клеток и подсчитывают поверхностную плотность антигенов. Для этой цели измеряют интенсивность флюоресценции нескольких клеток с известной поверхностной плотностью антигенов и определяют среднее значение флюоресценции.

Зависимость интенсивности флюоресценции от количества антигена может быть продемонстрирована калибровочными кривыми, для построения которых используют конъюгацию 131 - иммуноглобулинов с эритроцитами в различных количествах, а затем сравнивают интенсивность радиоактивного излучения и МИФ для одинаковых количеств Ig.

Проточный флюоресцентный денситометр: современные приборы этого типа (например, FACS IV, Becton Dickinson, США) сочетают способность к идентификации и разделению клеток и клеточных компонентов по их величине или флюоресцентному .маркеру.

Телевизионный увеличитель: конвенциональный флюоресцентный микроскоп соединен с телекамерой, увеличителем изображений, монитором и видеорекордером. Такая комбинация позволяет повысить чувствительность МИФ при одновременном уменьшении интенсивности возбуждающего света. Флюорохромы поэтому выцветают не так быстро, а флюоресцирующие структуры живых клеток можно наблюдать в течение 30 и более минут.