Главная

Метод E-розеток. Методика

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: 0,15 М NaCl, среда Игла-MEM с рН 7,4, подведенная с помощью 1 М NaOH, гепарин без консервантов (например, Gedeon Richter, Будапешт), раствор фиколл — визотраст с плотностью 1,077 г/мл, трипановый синий 0,2% в 0,15 М NaCl.

Также нужно иметь центрифужные пробирки на 10 мл (силиконизированные), пастеровские пипетки, центрифуги, гематокритную центрифугу, камеру для подсчета клеток, микроскоп с фазово-контрастной оптикой, ротор для ресуспендирования клеток.

Получение лимфоцитов.

Для определения РОК необходимы лимфоциты, по возможности минимально загрязненные аутологическими эритроцитами. Для получения лимфоцитов подходит метод Бейюма (см. также раздел «Разделение клеток иммунной системы»): 2 мл гепаринизированной крови (100 ЕД гепарина/мл) разводят 6 мл среды Игла-MEM и осторожно наслаивают в центрифужную пробирку на 2 мл сепарирующего раствора. Центрифугируют 40 минут при 600 g. Лимфоциты скапливаются в виде полосы белого цвета над сепарирующим раствором. Их отсасывают пастеровской пипеткой и отмывают средой Игла-MEM, центрифугируют 3 раза по 10 минут при 600 g и еще один раз при 200 g, устанавливают плотность суспензии, равную Зх11⁶ клеток/мл.

Инкубация.

Из трижды отмытых в 0,15 М NaCl ЭБ делают 0,5% суспензию в среде Игла-MEM. Равные объемы суспензии лимфоцитов и ЭБ (например, 0,5 мл) смешивают в центрифужной пробирке, центрифугируют в течение 5 минут при 200 g и сохраняют при 4°С в течение ночи.

Оценка результатов.

Важным этапом является ресуспендирование осадка. Требуется определенный опыт, чтобы при покачивании и вращении центрифужных пробирок не разрушить розетки. В нашей лаборатории для ресуспендирования пользовались ротором (угол качания 45°, 6 об/мин, 15 минут). При помощи пастедовской пипетки заполняют счетную камеру и в условиях фазового контраста подсчитывают по меньшей мере 200 лимфоцитов с целью определения РОК- При подсчете РОК учитывают лимфоциты с 3 и более адгезировавшими эритроцитами. Жизнеспособность клеток определяют окрашиванием 0,2% раствором трипанового синего. Розетки фиксируют 0,8% раствором глутарового альдегида. В течение 1—2 недель розетки можно хранить в 1% агарозе.

Модификации метода.

Сокращение используемых объемов крови достигается следующей модификацией: в пробирку вносят 200 мкл среды Игла-МЕМ, 100 мкл суспензии лимфоцитов (3х10⁵ клеток) и 100 мкл 5% суспензии ЭБ, инкубируют 10 мин при 37 °С, ресуспендируют (ротор), центрифугируют 15 минут при 200 g и оставляют на ночь при 4°С. В среднем наблюдается 61 ± 8% РОК. Обработка эритроцитов АЭТ (2-аминоэтилизотиоурония гидробромид) стабилизирует розеткообразование и дает до 80% розеток. Приготовление ЭБ, обработанных АЭТ: 1 мл осадка отмытых ЭБ смешивают с 4 мл раствора АЭТ (0,402 г АЭТ в 10 мл дистиллированной Н₂0, рН подводят 4М NaOH до 9,0). Смесь инкубируют 15 минут при 37 °С, затем отмывают трижды в 0,15М NaCl. Осадок суспендируют в среде Игла-МЕМ с 20% сыворотки эмбрионов коров до получения 10%. суспензии ЭБ.

Максимально АЭТ — ЭБ могут храниться в течение недели - при 4°С. Для получения розеток смешивают 0,5 мл суспензии лимфоцитов (2х10⁶/мл), 0,25 мл сыворотки эмбрионов коров и 6—8 капель АЭТ — ЭБ, центрифугируют 5 минут при 25 g и оставляют на ночь при 4°С. ЭБ можно также стабилизировать ЧСА: 50 мкл суспензии лимфоцитов (2х10⁶/мл) смешивают с 50 мкл 1% суспензии ЭБ и 20 мкл человеческий сывороточный альбумин (20% в среде Игла-MEM) в маленьких стеклянных пробирках инкубируют 75 мин при 4°С, затем добавляют 200 мкл среды и ведут подсчет. Добавление 20 мкл смеси этидий-бромида с акридиновым оранжевым позволяет дифференцировать живые (зеленое окрашивание) и неживые клетки (красное окрашивание). Результаты, полученные этим методом, коррелируют на 95% с результатами, полученными при помощи метода моноклональных АТ (антитело) (ОКТЗ). Для реакции торможения розеткообразования используют суспензию лимфоцитов (4х10⁶/мл) в среде Игла-MEM. В пробирку вносят 100 мкл суспензии лимфоцитов, 200 мкл антилимфоцитарных АГ в разведении 1 : 2000—1 : 256000 инкубируют 90 мин при 37°С, добавляют 100 мкл 0,5% суспензии ЭБ, инкубируют 10 минут при 37°С, центрифугируют 5 минут при 200 g, выдерживают 90 минут на ледяной бане. После осторожного ресуспендирования проводят подсчет розеток. Минимальную концентрацию, при которой отмечается торможение антилимфоцитарных АТ (антитело) (концентрация, вызывающая 25% снижение розеткообразования по сравнению с контролем) определяют графически.

Известен микрометод определения РОК в планшетах Терасаки. Под слоем вазелинового масла смешивают 2 мкл суспензии лимфоцитов (8х10³ клеток), 1 мкл суспензии ЭБ, 3 мкл 2% раствора альбумина, центрифугируют и после 1 часа инкубации при 4°С производят подсчет, используя в качестве фиксатора глутаровый альдегид.