Главная

Культивирование гибридом in vitro и in vitro

Культивирование гибридом in vitro

Когда клетки становятся достаточно многочисленными, их переносят в лунки объемом 1—2 мл. Для этого за 2 дня до переноса гибридом в планшеты для культивирования (например, Linbro с 24 лунками) вносят ядросодержащие сингенные клетки селезенки (по 5х10⁵ клеток в лунку). Гибридомы аккуратно суспендируют при помощи движений поршня пипетки и переносят по 100 мкл из каждой исходной лунки в 2 лунки объемом 1 мл. .Начиная с 5-й недели после слияния, трижды производят замену среды (ГТ, а не ГАТ). В дальнейшем можно вести культивацию в обычной культуральной среде.

В лунках объемом 2 мл гибридомы так разрастаются, что их переносят в планшеты с четырьмя лунками по 5 мл. Стабильные гибридомы можно переносить в культуральные сосуды по 25—50 мл. На этой стадии можно заменять сыворотку плода коровы нормальной сывороткой коров или лошадей. В этих сосудах среду следует также менять каждые 3—4 дня. На этом этапе можно получить достаточное количество клеток для культивирования in vivo на сингенных мышах.

Отбираемые при смене среды моноклональные антитела можно использовать для характеристики специфичности и молекулярных особенностей иммуноглобулин. В среднем концентрация моноклональных антител в культуральной среде составляет 10—50 мкг/мл.

Культивирование гибридом in vivo

Сингенным мышам предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл полужидкого парафина (DAB 7, VEB Leunawerke, Merseburg) или пристана (Koch-Light Lobs). Через 1—4 недели после предварительной обработки внутрибрюшинно вводят по 2х10⁷гибридных клеток каждому животному. В асцитической жидкости мышей концентрация моноклональных антител может достигать 5—10 мг/мл. Содержащиеся в асцитической жидкости гибридомы можно перевивать другим мышам после предварительной обработки (см. выше).