Главная

Расщепление пепсином

Материалы и оборудование

Для работы необходимы: кроличий IgG, кристаллический пепсин, 0,1 М ацетатный буфер с рН 4,5, 1 М NaOH, Na2S04.

Методика

Обрабатывают 2 г IgG кролика 20 мг кристаллического пепсина в 76 мл ацетатного буфера с рН 4,5, проводят гидролиз в течение 20 ч при 37°С.

Смесь центрифугируют, рН надосадочной фракции доводят до 8,0 1 М NaOH. Медленно при комнатной температуре и при постоянном помешивании добавляют раствор сульфата натрия (25 г/100 мл) до конечной концентрации 18 г/100 мл. Осадок собирают центрифугированием, растворяют в воде и диализуют против 0,1 М ацетата натрия.

Обсуждение

При фрагментации IgG пепсином образуются Р(аb´)2-фрагменты с константой седиментации 5S, остальная часть молекулы распадается на низкомолекулярные пептиды. Очистку фрагментов проводят методом гель-фильтрации. Первое разделение проводят на сефадексе G-100; нефрагмеитированный IgG удаляют на сефадексе G-150, дальнейшую очистку ведут на КМ-сефадексе G-25 в 0,02 М ацетатном буфере с рН 5,5. После восстановления 0,01 М меркаптоэтиламином в течение 75 мин в 0,1 М ацетатном буфере с рН 5,0 из Р(аb´)2-фрагментов образуются моновалентные Fab´-фрагменты; этот процесс обратим (окисление), если не проводилось алкилирование. При восстановлении 0,1—0,2 М меркаптоэтанолом образуются легкие цепи и Fd´-фрагменты. Относительная молекулярная масса Fd´-фрагмента IgG человека составляет 31 500. Его можно отделить от легких цепей хроматографией на сефадексе G-100 в 6 М мочевине с 0,1 М уксусной или 1 М пропионовой кислотами.

Под воздействием пепсина образуется также pFc´-фрагмент с отн. мол. массой 26 000. Он выходит с сефадекса G-150 во втором пике и может быть очищен повторной хроматографией на сефадексе G-50. pFc´-фрагмент состоит из двух ковалентно связанных субъединиц. Папаином расщепляют pFc´- на Fc´-фрагмент и пептиды (см. рисунки ниже).

Схема получения фрагмента pFc1

Схема получения фрагмента pFc1

pFc1- и Fc'-фрагменты IgG

pFc1- и Fc'-фрагменты IgG

Раb´-фрагменты оказались очень полезными для использования в методе меченных ферментом антител. F(ab´)2- и Fab´-фрагменты IgG кролика получают по следующей методике.

а) Получение F(аb´)2-фрагментов

— IgG растворяют в ацетатном буфере с рН 4,1
— К 100 мл IgG добавляют 2 мг пепсина. Концентрация IgG должна составлять 20—30 мг/мл
— Инкубация 20 ч при 37 °С
— Реакцию останавливают подведением рН до 7,0
— Выделяют F(аb´)2-фрагменты хроматографией на сефадексе G-150 или сефакриле S-200

б) Получение Fab´-фрагментов

— F(аb´)2-фрагменты диализуют против 0,55 М трис-HCl-буфера с рН 8,2 по меньшей мере 4 ч
— Добавляют меркаптоэтанол до конечной концентрации 0,2 М
— Оставляют на 10 мин при комнатной температуре, охлаждают до 0°С, добавляют перекристаллизованный из дистиллированной Н20 йодацетамид до концентрации 0,3 М. Оставляют смесь на 1 ч при 0°С и затем диализуют против физиологического раствора
Известен также «мягкий» метод получения Fab´-фрэгментов против IgG коз
— F(аb´)2-фрагменты растворяют в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,0, содержащем 0,3 М NaCl
— Раствор F(аb´)2-фрагментов пропускают через колонку с сефарозой 4 В (10x30 мм), конъюгированной с IgG козы
— Элюируют фосфатным буфером с рН 7,0, содержащим 0,2 М NaCl
— Fab´-фрагменты элюируют тем же самым буфером с добавлением 0,01—0,12 меркаптоэтаноламина и 0,001 ЭДТА
F(аb´)2-фрагменты из IgG крупного рогатого скота получают по следующей методике
— 2 г IgG растворяют в 50 мл 0,15 М NaCl
— Добавляют 50 мл 0,4 М ацетатного буфера с рН 4,0, затем 80 мг трижды перекристаллизованного пепсина
— Инкубируют 24 г при 37 °С на водяной бане
— Доводят рН до 8,02 М NaOH
— Диализуют надосадочную фракцию против физиологического раствора в течение 5 дней
— Добавляют ZnS04 до конечной концентрации 0,025 М для преципитации IgG и Fc
— Перемешивают 2 ч при комнатной температуре, центрифугируют
— Добавляют ЭДТА-натриевую соль (10 г/л)
— Диализ против ФСБ, продукт реакции состоит из F(ab´)2- и Fаb´-фрагментов

Для получения F(аb´)2-фрагментов из небольших количеств сыворотки пепсиновому протеолизу подвергают глобулиновую фракцию. Затем проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-150. Во втором пике присутствует F(ab´)2. Оптимальные условия расщепления IgG различных биологических видов пепсином определяют под контролем диск-электрофореза с ДСН. Известны различия в чувствительности к пепсину в пределах субкласса IgG, например, у крыс они выражены следующим образом: IgG 2c>IgG 2b>IgG 2a>IgG 1.

Протеолиз IgM человека пепсином приводит через 8 ч к его полному распаду на пептиды. Более короткий по времени протеолиз приводит к образованию F(ab´´)2μ, распадающиеся потом на Fab´μ. Фрагменты выделяют методом гель-фильтрации на сефадексе G-200, их обозначают F(ab´)2 (IgM) или Fab pep (IgM).