Главная

Определение ферментативной активности иммунных преципитатов

Определение ферментативной активности может служить не только для характеристики иммунных преципитатов, но и для повышения чувствительности метода. Блокада активных центров фермента в результате иммунной реакции наблюдается редко. Как правило, активность фермента сохраняется и после реакции антиген — антитело. Ферменты и нзоферменты можно выявлять после элюции из геля, окрашивать непосредственно в геле, пользоваться гелем, содержащим субстрат, применять сэндвич-метод или метод контактной пленки. Ввиду термолабильности большинства ферментов пластины с гелем в ходе электрофореза необходимо охлаждать. Обычно пластины с гелем, подлежащие выявлению ферментативной активности, не высушивают. Отдельные ферменты, например, карбоксиэстеразы сохраняют активность и в высушенных пластинах. Мы приводим только несколько методик выявления ферментативной активности в иммунных преципитатах в гелях. Исчерпывающие данные имеются в публикациях Uriel и Clausen.

Оксидоредуктазы

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ):

Раствор 1.
KCN - 50 мг
Хлористый диметилтиазолилтетразолий (или нитро-синий хлористый тетразолий) - 30,0 мг
0,1 М фосфатный буфер рН - 7,5

Раствор 2.
Феназинметосульфат - 10,0 мг
Дистиллированная вода - 10,0 мл

Оба раствора можно хранить раздельно в течение 4 недель при 4 °С. Раствор 2 хранят в темной склянке. Среду для инкубации готовят непосредственно перед использованием.

Среда для инкубации:
Раствор 1 - 7,2 мл
Раствор 2 - 0,2 мл
НАД - 5,0 мг
DL-лактат лития - 25,0 мг

Определение изоферментов ДЛГ проводят во влажной пластине после удаления непреципитировавших белков. Реакция заканчивается через 1—2 ч при 37 °С. Первые видимые полосы проявляются через 20 минут. Фиксацию проводят при комнатной температуре в течение 30 минут спиртовым раствором уксусной кислоты:

Этанол - 150,0 мл
Ледяная уксусная кислота - 10,0 мл
Дистиллированная вода - 40,0 мл

Препараты, содержащие компоненты с активностью ЛДГ, дают полосы преципитации сине-фиолетового цвета.

Церулоплазмин (пара-дифенолоксидаза). 21,6 мг пара-фенилендиамина растворяют в 100 мл натрий-ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,7), подогревают до 37 °С и немедленно используют. Инкубация продолжается 2 ч, после инкубации проводят отмывку смесью спирта и натрий-ацетатного буфера:

0,2 М ацетат натрия - 50,0
0,2 М уксусная кислота - 50,0
50% этанол - 100,0

Церулоплазмин, обладающий оксидазной активностью, окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Для контроля в параллельном опыте используют ингибирующее влияние азида натрия на оксидазы (добавляют к инкубационной смеси 1 мл 0,1 М NаN3), которое предотвращает окрашивание.

Гидролазы

Карбоксилэстераза. В качестве субстрата используют α-нафтилацетат, расщепляемый ферментом на нафтол и уксусную кислоту, с солями диазония α-нафтол реагирует, образуя азокрасители, которые могут служить индикатором реакции.

Среда для инкубации готовится непосредственно перед употреблением:

α-Нафтилацетат - 10,0 мг
Ацетон - 0,25 мл

Оба компонента смешивают, затем добавляют:

0,1 М   фосфатный   буфер
рН 7,4 - 25,0 мл
Прочный синий В - 20,0 мг

Раствор необходимо профильтровать.

Инкубируют при комнатной температуре в течение 30— 60 минут. Преципитаты, обладающие активностью карбоксилэстеразы, окрашиваются в коричнево-красный цвет.

Щелочная фосфатаза.

Раствор для инкубации:
Нафтилфосфат натрия - 20,0 мг
Прочный синий В - 20,0 мг
0,1 М веронал-солянокислый буфер рН 9,0 - 20,0 мл

Раствор фильтруют. Пластины инкубируют в течение 30— 60 минут при комнатной температуре, фиксируют 5% уксусной кислотой, отмывают водой в течение 1 часа. Ферментативная активность проявляется винно-красным окрашиванием.