| |
Главная
|
Определение количества генов до «эры клонирования»Одним из первых вопросов, заинтересовавших молекулярных биологов, был вопрос о количестве генов Ig в геноме. Возможности методов, применявшихся до появления техники клонирования, были с современной точки зрения ограниченными; тем не менее они позволили отказаться от одной из обсуждавшихся тогда моделей. Эта модель в отличие от гипотезы Дрейера и Беннетта (Dreyer, Bennett) постулировала, что в гаметном геноме присутствует огромное число полных (т. е. V + С) генов Ig, кодирующих весь антительный репертуар организма. В 1974—1977 гг. эта модель была опровергнута в нескольких лабораториях в результате «подсчета генов» с помощью ДНК-зонда, комплементарного очищенной мРНК каппа L-цепей. Для получения таких χ-специфических мРНК клетки χ-секретирующих миелом лизировали и из лизата осаждали полисомы. (Некоторые исследователи пытались получить обогащенные χ-синтезирующие полисомы с помощью иммунопреципитации вновь образованных χ-цепей анти-χ-антителами). Затем из полисом экстрагировали РНК, а из нее путем гибридизации с oligo-dT — мРНК (почти все типы матричной РНК содержат poly А-«хвост», который может гибридизоваться с комплементарным oligo-dT). Дальнейшая очистка χ-специфической мРНК достигалась путем фракционирования РНК по размеру при центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы. Затем, инкубируя χ-мРНК с радиоактивномеченными предшественниками ДНК и вирусным ферментом — обратной транскриптазой, получали комплементарную меченую ДНК (кДНК). Такие радиоактивные зонды χ-кДНК были использованы для оценки числа χ-подобных генов в геномной ДНК путем изучения кинетики гибридизации, происходящей при отжиге радиоактивной кДНК с комплементарными ей последовательностями геномной ДНК. В основе этого хорошо известного метода лежит следующая закономерность: гибридизация происходит быстро, если изучаемая ДНК содержит много копий последовательностей, комплементарных зонду. Если же таких последовательностей мало, то и отжиг протекает медленно, так как для нахождения зондом комплементарного участка понадобится больше времени. Эти эксперименты показали, что число генов С-области в гаплоидном геноме значительно меньше, чем постулируется моделью «гаметного разнообразия», согласно которой в гаметном геноме содержится множество полных х-генов. Однако присущая методу погрешность не позволила определить точное число копий гена х С-области. Доказать, что в геноме присутствует только одна его копия, оказалось возможным только с появлением методов рекомбинатных ДНК. Чтобы понять суть проведенных экспериментов, а также последующие достижения, необходимо сделать краткое отступление, посвященное этим мощным методам. |