Главная

Регуляция перестроек иммуноглобулиновых генов

Процессы рекомбинации генов иммуноглобулинов — одни из самых важных в развитии клеток В-ряда. Рекомбинация сопровождается необратимыми делециями участков генома. При этом определяется, какой изотип L-цепи и какая из пар V_L-V_H будут экспрессироваться во всех последующих поколениях. Можно думать, что такие важные процессы должны четко регулироваться. Действительно, то, что каждая линия В-клеток экспрессирует только один изотип L-цепи (изотипическое исключение) и использует только один из двух гомологичных хромосомных локусов для генов Н- и L-цепей (аллельное исключение), означает, что эти процессы тем или иным способом регулируются. Хотя к настоящему времени механизмы такой регуляции изучены еще недостаточно, имеется некоторый прогресс по крайней мере в описании последовательности событий, происходящих с этими генами. Общий подход в работах такого рода состоял в изучении перестроек и экспрессии генов Ig в различных клеточных линиях (лейкозы, лимфомы, гибридомы, миеломы), представляющих собой лимфоциты, остановленные на различных стадиях развития путем слияния или злокачественной трансформации.

Наиболее примитивный тип клеток В-ряда — это пре-В-клетки, содержащие по определению μ-цепи в цитоплазме, но не несущие IgM на поверхности. В ряде экспериментов такие клетки из эмбриональной печени мыши иммортализировали либо слиянием — с получением гибридом, либо трансформацией вирусом лейкоза мышей Абельсона (A-MuLV). Был исследован ряд линий обоих типов. Как правило, методом блоттинга по Саузерну в ДНК этих клеток не выявлялось перестроек генов L-цепей, но наблюдались одна-две перестройки J_H-генов. Некоторые линии, трансформированные A-MuLV, по- видимому, претерпевали перестройку генов-J_H в культуре. Несмотря на отсутствие перестроек в генах х, некоторая транскрипционная активность этих генов, по всей видимости, наблюдалась, так как удалось зарегистрировать РНК-транскрипт длиной 8,4 тн, содержащий х последовательности С-области. Такие транскрипты, предположительно инициирующиеся на промоторе, расположенном с 5'-стороны от гаметного гена х, были ранее обнаружены в некоторых миеломах.

Последующие события в ходе созревания В-клетки, по-видимому, заключаются в перестройке гена L-цепи, синтезе L-цепи и появлении Ig на поверхности клетки, что отвечает переходу от пре-В кВ-клетке. Взаимосвязь между синтезом легких цепей и появлением поверхностных Ig (sIg) исследовали на нетрансформированных клетках, выделенных из печени поздних эмбрионов и новорожденных мышей. Когда популяцию таких клеток фракционировали адсорбцией на чашках, покрытых анти-Ig, L-цепи выявлялись в sIg⁺- клетках, но не обнаруживались в sIg-клетках. Это позволяет предположить, что появление sIg происходит немедленно вслед за синтезом L-цепи. Последующая активация В-клеток антигеном к пролиферации и созреванию в плазматические клетки, способные секретировать антитела, выходит за рамки этой главы, а взаимосвязь этих процессов с переключением изотипа и соматическими мутациями мало изучена.

Явления аллельного и изотипического исключения изучались в нескольких лабораториях. Были предложены две основные модели. Согласно стохастической модели, обнаруживаемое в клетках большое число дефектно перестроенных генов указывает на то, что функциональные перестройки происходят редко; аллельное исключение вытекает при этом из низкой вероятности совпадения двух маловероятных событий в одной и той же клетке. Так, например, если функционально перестроенные гены х составляют лишь 10% от всех перестроек этих генов, то только 1% клеток будет обладать двумя функционально перестроенными генами. Это отклонение от правила аллельного исключения, вероятно, максимальное из согласующихся с экспериментом. При таких соотношениях 81% клеток будет содержать два нефункциональных гена (0,9*0,9 = 0,81) и окажется в «отходах». Подобный расчет с учетом L- и Н-цепей приводит к предсказанию, что в «отходах» окажется более 96% клеток (нефункциональные перестройки либо в L-, либо в Н-цепях), что кажется неоправданно расточительным. В этой модели низкая частота λ-продуцирующих клеток — статистическое следствие меньшего репертуара способных к перестройке генов V_λ.

Модель, альтернативная стохастической, может быть названа «регуляционной». Согласно этой, более распространенной в настоящее время, точке зрения, функциональная перестройка гена L- (или Н)-цепи ингибирует дальнейшие перестройки генов L- (или Н-) цепей в той же клетке посредством некоего регуляторного механизма. В случае быстрого ингибирования такой механизм может не допустить одновременной экспрессии обоих аллельных генов и привести к аллельному исключению вне зависимости от частоты нефункциональных перестроек. Специфическим сигналом, с помощью которого клетка «чувствует» функциональную перестройку Н-цепи, может служить синтезированный μ-белок. Альтернативный гипотетический механизм, узнающий нуклеотидную последовательность «правильно» перестроенного VDJ-района ДНК или РНК, сталкивается с трудностями при определении перестроек с нарушением рамки считывания вследствие вариабельности длины D-фрагмента. Кроме того, трудно представить себе, чтобы какая-нибудь система, узнающая нуклеотидную последоватеьность, могла бы опознавать находящиеся в рамке считывания терминирующие кодоны, которые могут присутствовать в псевдогене V_H, завершая корректирование перестройки VDJ. В клетках, продуцирующих нормальную μ-цепь, по-видимому, присутствует некий регуляторный сигнал, поскольку в более примитивных клетках, не продуцирующих р,-цепей, не наблюдаются перестройки гена L-цепи. Но если белок μ может служить сигналом, разрешающим перестройку L-цепи, то он с тем же успехом может быть и сигналом, запрещающим последующую перестройку Н-цепи.

В пользу подобного регуляторного механизма, блокирующего ненужную перестройку L-цепи, убедительно свидетельствуют работы по рекомбинации генов х и λ, в происходящих от лимфоцитов линиях клеток больных лейкозом и лимфомой. В этих работах Хитер и др. и Корсмейер и др. методом блоттинга по Саузерну изучали структуру генов L-цепей как в х- и λ,-секретирующих клетках, так и в несекретирующих (клетках типа ни-Т/ни-В при остром лимфоцитарном лейкозе). Как и предполагалось, в х-секретирующих клетках были перестроены гены х, а в λ,-секретирующих — гены λ. Неожиданным оказалось то, что при использовании гетерологичных зондов гены λ в х-секретирующих клетках были совершенно незатронуты, тогда как гены х клеток, секретирующих λ, были обычно делегированы или по крайней мере перестроены. Такая асимметрия результатов заставила предположить, что х-перестройки должны предшествовать λ-перестройкам и, кроме того, что присутствие функционального белка х (сигналом, возможно, служит появление на мембране L₂H₂) блокирует перестройку λ. Результаты этих экспериментов позволили сформулировать следующие гипотетические правила регуляции, объясняющие как изотопическое, так и аллельнре исключение: а) присутствие нормальных μ-цепей останавливает дальнейшие перестройки Н-цепей, но запускает перестройку генов х; б) появление L₂H₂ на мембране блокирует дальнейшие перестройки L- цепи; в) перестройки или делеции гена х в обоих аллелях запускают перестройку λ.

Согласно этим правилам, пре-В-клетки могут «пробовать» получить функциональные L-цепи с четырех хромосомных локусов; сначала с двух аллелей х, а затем, если обе перестройки х окажутся безуспешными, с двух аллельных локусов λ (возможно, что в хромосоме, несущей гены λ, последовательным перестройкам могут подвергаться различные неаллельные гены λ). Клетка, непродуктивно перестроившая все локусы генов L-цепей, превращается в 0-клетку, в конечное дифференцированное состояние. Типы клеток, запрещаемые этими правилами, т.е. клетки с перестроенными генами х и только гаметными генами μ, клетки с перестроенными генами λ и только гаметными генами х, а также клетки, синтезирующие одновременно х и λ-цепи, в этих линиях человеческих клеток не наблюдались, тогда как почти все разрешенные типы клеток были обнаружены. Следует отметить, что делеции генов х, имеющие место в λ-секретирующих клетках, очевидно, совершенно отличаются от нефункциональных перестроек генов V-J, наблюдающихся как «вторичные» перестройки в клетках, секретирующих х. Механизм этих делеций неизвестен, как неизвестна и природа сигнала, при помощи которого эти делеции, видимо, «разрешают» перестройку генов λ.